信帆生物：游離脂肪酸（NEFA）檢測(cè)試劑盒的正確使用方法

一、測(cè)定原理：

游離脂肪酸（NEFA）能與銅離子結(jié)合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比。用銅試劑測(cè)定其中銅離子的含量，即可推算出游離脂肪酸的含量。

二、試劑組成與配制（50管/48樣）：

試劑一：氯--仿（分析純），自備。

試劑二：緩沖液，40mL×1瓶，室溫保存6個(gè)月。

試劑三：銅試劑，甲液30mL×1瓶，乙液 30mL×1瓶，丙液 5mL×1瓶，4℃保存6個(gè)月。試劑三銅試劑的配制：按甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1的比例進(jìn)行配制，需多少配多少，配好后4℃可保存二周。

試劑四：顯色劑，粉劑×2支，稀釋液10mL×2瓶，4℃保存3個(gè)月。試劑四顯色劑的配制：臨用時(shí)將1支粉劑溶解于1瓶10mL稀釋液中，配好后4℃可保存二周。

試劑五：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×2支，溶劑50mL×1瓶，4℃保存3個(gè)月。1000µmol/L棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制：將一支粉劑用溶劑溶解后定容至20mL（注意用溶劑將裝粉劑的小離心管洗凈）。

試劑六：雙蒸水40mL×1瓶（做空白管用）。

三、操作步驟：

1、分別取玻璃試管進(jìn)行編號(hào)（最好用帶蓋的磨口試管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，防止試劑揮發(fā)及更好的抽提）。

2、操作表：

[注]：詳細(xì)操作步驟：

1、充分混勻準(zhǔn)確抽提2分鐘（用秒表計(jì)時(shí)）。如果您沒有磨口試管，可用普通玻璃試管代替，但必須用保鮮薄膜封口，以便防止液體揮發(fā)及濺出。

2、抽提完后以3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，若發(fā)現(xiàn)下層液體呈半凝固狀態(tài)、凝固層較厚或下層液體不足2mL時(shí)，則可用小玻棒或移液器吸嘴輕輕攪拌后再次離心，直至分層清楚。

3、 然后用注射器接上硬膜外麻醉針套吸取上層液體及凝固層并棄之。

4、另取一個(gè)注射器及硬膜外麻醉針心針套，將硬膜外麻醉針心插入針套中，小心插入下層抽提液中，拔出針心，接上注射器，吸取下層抽提液2.3～2.5mL至另一試管中。（這樣可避免上層液體及凝固層混入下層液體中，若混入上層液體及凝固層，則需重新離心后再取下層抽提液，否則會(huì)影響結(jié)果。）若偶然發(fā)現(xiàn)抽提液有霧狀混濁，可放入37℃水浴1～2分鐘即可。

5、再從上述試管中準(zhǔn)確吸取2mL下層抽提液加入另一試管中，加顯色劑進(jìn)行顯色。

6、比色皿在用雙蒸水沖洗干凈后，還必須用無水乙醇沖洗，然后加三氯--甲-調(diào)零，否則加入的三氯--甲-中會(huì)混有水珠（三氯--和水不互溶）。

7、操作工程中最好用玻璃管，某些材質(zhì)的塑料離心管也可使用（用加入三氯---烷的方法驗(yàn)證是否可用）。

以上七點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。硬膜外麻醉針本所有售。

四、計(jì)算公式及舉例：

1、血清計(jì)算公式及舉例：

①、公式：見說明書

②、計(jì)算舉例：

取某人血清0.2mL按操作表進(jìn)行游離脂肪酸測(cè)定。測(cè)得各管吸光度如下：空白管為0.045，標(biāo)準(zhǔn)管為0.311，測(cè)定管為0.159。則計(jì)算如下：

   2、組織樣本計(jì)算公式及舉例：

①、公式：見說明書

Cpr：組織樣本蛋白濃度，gprot/L（prot指蛋白）。

注：非蛋白樣可以將樣本質(zhì)量濃度替換蛋白濃度代入計(jì)算。

②、計(jì)算舉例：見說明書

取大鼠10%肝組織勻漿上清液0.2mL按操作表進(jìn)行游離脂肪酸測(cè)定。測(cè)得各管吸光度如下：空白管為0.045，標(biāo)準(zhǔn)管為0.311，測(cè)定管為0.293。10%肝組織中蛋白濃度為12.24g/L，則計(jì)算結(jié)果如下：

五、注意點(diǎn)：

1、實(shí)驗(yàn)必須用分光光度計(jì)比色，不可用酶標(biāo)儀、半自動(dòng)及全自動(dòng)生化分析儀比色（有機(jī)溶劑對(duì)這些儀器會(huì)有損壞）。

2、顯色前吸取下層抽提液時(shí)，吸管不要觸及管壁，以免沾染管壁上粘著的銅試劑。下層抽提液必須清澈，否則會(huì)使結(jié)果偏高。

3、膽紅素可被試劑一抽提而干擾比色，故黃疸血清須做一對(duì)照管，即最后不加顯色劑而用正丁醇代替，在測(cè)定管光密度讀數(shù)中減去此對(duì)照管的光密度讀數(shù)。